Рестрикционна ендонуклеаза

Рестрикционните ендонуклеази (съкр. рестриктази) са група от ензими, отговорни за специфичното разкъсване на ДНК молекули до отделни полинуклеотидни фрагменти.

В действителност рестрикционните ендонуклеази разпознават къса ДНК секвенция, в която най-често се извършва и самият каталитичен акт, но е възможно мястото на разпознаване (разпознавателна секвенция) да е пространствено отдалечено от мястото на разкъсване.

Познати са около 3500 рестрикционни ензими, разпознаващи над 250 различни ДНК секвенции. Рестриктазите са характерни за клетките на еубактериите, но са изолирани и ензими от вируси, архебактерии и от еукариотни организми. Статистическите данни сочат, че около 25% от всички бактерии съдържат поне един вид рестрикционна ендонуклеаза, а при някои бактериални щамове броят в отделната клетка може да достигне седем и повече.

Рестрикционните ендонуклеази се превръщат в необходим инструмент на генното инженерство непосредствено след откриването им. Периодът в който за пръв път се изолират ензими с ендонуклеазна активност е предшестван от откритието на феномен известен като контролирана рестриктивна модификация. Този феномен е описан от Лурия и Бертани при отглеждане на бактериофаги върху различни бактериални щамове.

Значението на рестрикционните ендонуклеази за ДНК-клонинга в молекулярната биология е официално признато през 1978 г., когато Хамилтън Смит и Даниел Нейтънс поделят Нобеловата награда за физиология или медицина, отсъдена за техния принос в откриването на рестрикционните ендонуклеази и внедряването им в практиката.

Типове

Ензимната номенклатура на NC-IUBMB класифицира рестрикционните ендонуклеази, като хидролази, действащи върху естерни връзки от вътрешността на полинуклеотидната верига на дезоксирибонуклеиновата киселина и продуциращи 5’-фосфомоноестерни фрагменти. Това корелира с ензимен клас 3.1.21.--, в който попадат 6 индентификатора на ензими. Основните рестрикционни ензими са означени като място-специфични ендодезоксирибонуклеази от тип I, II и III, с индентификационни номера съответно 3.1.21.3, 3.1.21.4 и 3.1.21.5.

Забележка: Разграничават се и рестриктази от тип IV, но до 2005 г. NC-IUBMB все още не посочва индентификационен номер на класа.

Формално това са три ензима, всеки със своя характерна структура на субединиците, кофакторни изисквания, рестрикционна специфика и тип на асоциирана S-аденозилметионин: ДНК метилтрансфераза. Но именно поради специфичността на участъка, в който става разпознаването и вида на рестрикционните продукти във всеки един от типовете I, II и III могат да се диференцират отделни ензими, които показват различна активност спрямо секвенцията на субстрата (в случая ДНК). За това коректно е да се говори за рестрикционни ендонуклеази от тип I, II и III.

Съществува група ензими, означавана като самонасочващи се ендонуклеази (homing endonucleases). Това са рестриктази, кодирани от интронни или интеинни последователности, формирани чрез автосплайсинг (на английски: self-splicing) и ясно диференцируеми от познатите рестрикционни нуклеази от тип I, II и III.

Номенклатура

Номенклатурните изисквания към името на рестрикционните ендонуклеази отразяват по кратък и екзактен начин, биологичният вид от който е изолиран съответният ензим и типът на евентулен щам. За означаване на биологичния вид се използва трибуквена абревиатура, чиято първа буква е заимствана от родовото име, а втората и третата буква представляват съкратен запис на видовото име на микроорганизма (или и на подвидовото при определени случаи). Ако е необходимо да се цитира точно определен щам, това става чрез арабски цифри и латински букви, изписани след трибуквения код. С римски цифри се отбелязва съответна рестриктаза в случай, че от конкретния организъм могат да бъдат изолирани няколко.

Например:


Рестриктаза	Организъм
AaaI	Acetobacter aceti sub. aceti – първа рестриктаза
Eco24I	Escherichia coli RFL24 – първа рестриктаза
Eco47I	Escherichia coli RFL47 – първа рестриктаза
Eco47II	Escherichia coli RFL47 – втора рестриктаза
Eco47III	Escherichia coli RFL47 – трета рестриктаза
EcoKI	Escherichia coli K MG1655 – първа рестриктаза
EcoRII	Escherichia coli R245 – втора рестриктаза

При много специфични случаи на интрон или интеин кодираните ендонуклеази се използва префикс, с които се означава типа на ендонуклеазата. Той може да бъде I– (за интрон), PI – (протеинов инсерт) или F – (freestanding – свободна, некодирана в интрон или интеин, но в еукариотен организъм). Като примери могат да бъдат посочени:


Рестриктаза	Организъм
I-AniI	Aspergillus nidulans – първа рестриктаза
I-CpaII	Chlamydomonas pallidostigmatica – втора рестриктаза
PI-SceII	Saccaromyces cerevisae – втора рестриктаза
F-SceII	Saccaromyces cerevisae – втора рестриктаза

Разпознавателна секвенция

Това е специфична ДНК секвенция, която се разпознава от ензима. Наличието ѝ в определен ДНК фрагмент, определя дали рестрикционната ендонуклеаза ще реагира и ще разкъса фрагмента. Минималната дължина на такава секвенция е 4 нуклеотидни двойки, най-често срещаната дължина е 6 н.дв., но има и разпознавателни секвенции от 8 и много повече нуклеотида.

Повечето рестрикционни ендонуклеази реагират с участъци от ДНК, означавани като палиндромни или частично палиндромни. Палиндромът е полинуклеотидна секвенция, която се повтаря и в двете вериги на ДНК, носейки една и съща информация при четене строго в една посока (5’->3’) по дължината на веригата (т.е. всяка последователност, която има симетрия от втори ред). Като пример за палиндромни участъци могат да бъдат посочени следните таргетни последователности:

5' – Г А А Т Т Ц – 3' EcoRІ (E.coli)

3' – Ц Т Т А А Г – 5'

5' – Ц А Г Ц Т Г – 3' PvuІІ (Proteus vulgaris)

3' – Г Т Ц Г А Ц – 5'

Частично палиндромен е участък, в който има неспецифични нуклеотиди, нарушаващи симетрията от втори ред. В лингвистичен смисъл това са палиндроми (вж. палиндром), но в контекста на структурата на ДНК, разликите са съществени. Така например ензима StyI изолиран от Salmonella typhi 27, разпознава следните последователности:

5' – Ц Ц Т А Г Г – 3' (палиндром)

3' – Г Г А Т Ц Ц – 5'

5' – Ц Ц А А Г Г – 3' 5' – Ц Ц Т Т Г Г – 3' (частични палиндроми)

3' – Г Г Т Т Ц Ц – 3' 5' – Г Г А А Ц Ц – 3'

Т.е. реално ензима реагира на последователност 5' – Ц Ц W W Г Г – 3', където W = А или Т.Записана по такъв начин, секвенцията може да се разглежда като палиндром или да се превърне в палиндром при заместване с конкретни нуклеотиди (нарича се още палиндром с двусмислие).

Съществува и разпознавателна секвенция, означавана като прекъснат палиндром. Тя представлява участък с нарушена симетрия от втори ред поради наличието на вмъкнати, несъществени нуклеотиди, които най-общо се означават с лат. буква „N“. Броят на тези вмъкнати нуклеотиди може да бъде от 1 до 9. Например:

5’ – Ц А Ц N N N Г Т Г – 3’ AdeI (Alcaligenes denitrificans Ss 3 – 028)

3’ – Г Т Г N N N Ц А Ц – 5’

Друг тип прицелни последователности са двустранните разпознавателни секвенции. Това са прекъснати последователности без палиндромна симетрия в специфичните нуклеотиди. Като пример може да се посочи разпознавателната секвенция на ензима BcgI, изолиран от Bacillus coagulans:

5’ – (N)₁₀ Ц Г А (N)₆ Т Г Ц (N)₁₂ – 3’ BcgІ (Bacillus coagulans)

3’ – (N)₁₂ Г Ц Т (N)₆ А Ц Г (N)₁₀ – 5’

Съществува и тип разпознавателна секвенция, която се означава като непалендромна – това е непрекъсната последователност, която не притежава симетрия от втори ред, но характеризираща се със специфични нуклеотиди:

5’ – Ц Т Г Г А Г – 3’ Bco35I (Bacillus coagulans RFL35)

3’ – Г А Ц Ц Т Ц – 5’

Външни препратки